自复制RNA设计原理及应用

随着RNA体外合成和体内递送方法的出现，合成mRNA在生物医学应用方面引发众多关注。然而，在大多数生物系统中，外源性mRNA的半衰期有限，尤其是在快速分裂的细胞中。相比之下，病毒RNA可以通过在宿主内主动复制来延长其寿命。因此，它们可以作为设计合成自复制RNA（srRNA）的框架，可用于增加编码RNA的半衰期和细胞内浓度。合成srRNA可用于增强重组蛋白表达或诱导分化细胞重编程为多能干细胞。在这里将详细介绍srRNA的设计思路、病毒来源和目前面临的挑战，以及在mRNA疫苗、干细胞重编程等方向的应用。

01
srRNA的应用方向

1自复制RNA疫苗

随着新冠肺炎大流行的出现，mRNA疫苗率先进入临床试验，首批志愿者在SARS-CoV-2基因序列发布后10周内接受疫苗接种。用于疫苗应用的saRNA构建体来源于α病毒，如委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）或塞姆利基森林病毒（SFV），这些saRNA构建体包含四种非结构蛋白、一个亚基因组启动子和目的基因（取代病毒结构蛋白）。通过删除病毒结构蛋白，RNA无法产生感染性病毒，传递到细胞质后，非结构蛋白形成RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP），该聚合酶复制整个RNA链。四种非结构蛋白中的每一种都在RDRP的形成中发挥作用，这是一个复杂的多阶段过程，这种RNA复制导致抗原表达高于非复制的mRNA，在体内提供扩增和持久产生抗原的能力，加上强大的固有免疫刺激特性，以下整理了针对传染病和癌症的自复制RNA疫苗临床研究。

图1 srRNA的应用：使用srRNA编码Yamanaka因子，可以对完全分化的有丝分裂后细胞的基因组进行重新编程，以产生诱导多能干细胞（iPSC）。理论上，编码相应重编程因子的srRNA也可用于随后转分化为所需细胞类型，甚至产生iPSC衍生的类器官（虚线箭头和方框）。在无细胞翻译系统中，srRNA可以直接用作任何感兴趣基因的自扩增mRNA或功能性RNA，如核酶和适配体。编码抗原蛋白的srRNA可以用作基于RNA的疫苗。srRNA靶蛋白的表达导致抗原结构域的细胞外呈递，通过分泌、直接暴露在外膜上，或通过主要组织相容性复合体（MHC）进行抗原肽的蛋白水解和呈递，从而产生抗原特异性抗体。

▼针对传染病的srRNA疫苗

▼针对癌症的srRNA疫苗

2干细胞研究

诱导多能干细胞（iPSC）是再生医学最有前景的细胞之一，因为它们可以无限期增殖，并分化取代体内因疾病或损伤而失去的任何类型细胞。iPSC的形成可以通过诱导“重编程”转录因子Myc、Oct3/4、Sox2和Klf4的基因来实现，通常，这四个基因通过逆转录病毒或慢病毒系统引入，将所需基因整合到宿主基因组中。用这种方法将细胞重新编程为iPSC面临插入靶细胞基因组突变的风险，这对于细胞来说是不利的，甚至可能演化为肿瘤。利用mRNA非整合基因组编辑的方法是细胞重编程的一个有吸引力的替代方案（图1）。然而，这种方法通常受到mRNA半衰期有限的阻碍，需要每天转染，而srRNA可以更省时、更快、更有效的方式诱导多能性，使其更适合潜在的治疗应用。例如，细胞重编程可以用来源于仙台病毒（SeV）的RNA载体实现，这些载体已被证明不能进行感染性繁殖。研究表明，小鼠和人类成纤维细胞可以在SeV感染后14天编码四种Yamanaka改良因子，类似地，基于委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）的srRNA也可以成功地将成人成纤维细胞和肾上皮细胞重新编程为iPSC。

02
RNA自我复制的条件

1天然自复制RNA

srRNA有潜力成为传统基因组工程方法、非整合的替代品。然而，关于哪些RNA物种可以用于产生功能性srRNA的研究仍处于初级阶段。因此，为了了解哪些RNA系统可以转化为合成RNA复制子，有必要了解能够在体内或体外自我复制的RNA的工作机制。

据推测，自然界中最大的复制RNA群体是RNA病毒和类病毒。根据巴尔的摩病毒分类系统，没有DNA中间体的RNA病毒可以分为三组（III、IV、V），这取决于其基因组的整体结构和极性。因此，第III组由所有双链RNA病毒（dsRNA）组成，第IV组和第V组由分别具有阳性（+）和阴性（−）基因组极性的单链RNA病毒（ssRNA）组成。对于+ssRNA病毒，基因组RNA至少与其基因表达所需的mRNA部分相同，也就是说，它包含编码序列。在−ssRNA病毒的情况下，必须首先转录基因组链以产生包含编码序列的互补（+）链。因此，病毒RdRP是−ssRNA病毒病毒粒子的重要组成部分。dsRNA病毒基因组由（+）和（−）链RNA组成，它们与病毒RdRP一起包装在病毒衣壳中。在某些情况下，RNA病毒的完整基因组不是在单个RNA链上编码的，而是可以分为几个片段，类似于基因组信息在染色体之间的分布方式。重要的是，病毒基因组的（+）链版本不一定是唯一翻译的mRNA。在几种RNA病毒中，一些编码的基因是使用内部或亚基因组启动子从基因组（−）链转录的亚基因组转录物翻译而来的。

值得注意的是，最近发现的双链病毒（两条链上都有编码序列的ssRNA病毒）以及一些具有双链基因组的分段ssRNA病毒（具有正或反义极性的片段的组合）不属于第IV组或第V组，而是独立形成了另外一种分类。此外，在核糖病毒、类病毒以及可能的一些双病毒的情况下，ssRNA基因组可以被环化，从而保护RNA末端免受外泌核糖核酸酶的影响。

独立于分类，所有这些RNA物种的完全复制需要（+）和（−）链合成（图2a，b）。在线性+ssRNA和−ssRNA病毒的情况下，在复制基因组链之前，使用基因组链作为模板合成反向互补的抗原组链。在dsRNA病毒的情况下，基因组dsRNA的复制通常始于（+）链的合成，该链也用作病毒基因表达的mRNA。然后在该步骤之后使用新生（+）链作为模板合成第二链。

图2 复制RNA的类型：（a）可以复制线性单链RNA（ssRNA）、线性双链RNA（dsRNA）和环状ssRNA，对于分别具有（+）和（−）极性的线性ssRNA病毒，基因组RNA通过相反极性的抗原组RNA进行复制。在dsRNA病毒的情况下，复制从+ssRNA开始，通常最初转录为用于表达病毒基因的mRNA，使用（+）链作为模板合成互补（−）链，完成dsRNA复制。（b）类病毒和环状卫星病毒的环状ssRNA基因组可以通过滚动环状RNA合成进行复制，以抗原组RNA连接体的形式产生线性ssRNA中间体。在这些中间体的切割和环化之后，抗原组环状RNA的滚环复制产生初始基因组RNA的线性连接前体，其反过来可以被加工成最终的环状ssRNA。或者，一条链的线性中间体可以用作合成相应互补线性中间体的模板（灰色箭头）。

通常，核糖病毒、类病毒和潜在的双病毒的环状RNA的复制是基于滚环复制的，环状基因组RNA用作抗原组链的线性重复序列的连续合成的模板，这些连接体随后被加工成单体中间体，然后环化成环状抗原组RNA，然后环状抗原组RNAs可以作为类似合成新基因组环状RNA的模板。或者，在线性和环状RNA复制之间的杂交中，连接的线性中间体已经用作合成相应互补链的模板。通常，将线性连接体加工成环形产物需要共编码的核仁核酶或不同宿主因子的作用。

2srRNA的自主复制和编码潜力

RNA病毒，进而也是类病毒，在细胞内寄生。因此，它们不可避免地依赖宿主因素来完成其生命周期。然而，RNA自身复制的自主程度可能会有很大差异，区别于缺乏自身编码聚合酶的被动复制RNA和携带专用RdRP基因的“活性”srRNA，因此可能具有更广泛的宿主范围（图3）。

▲图3 基因组大小/复杂性和自主性的关系：基于各自RNA的大小/复杂性，被动复制和主动自复制线性（+）ssRNA物种的比较，以及相应组的例子。

类病毒和卫星RNA病毒（包括核酶病毒）是纯粹的被动复制，因为它们不编码任何RNA聚合酶。因此，它们完全依赖宿主聚合酶或共感染辅助病毒的聚合酶来扩增其基因组RNA。与这些简单的RNA病原体相比，所有非卫星RNA病毒至少编码RdRP酶亚基，随着基因组大小的增加，编码的RdRPs增加，因此RNA复制的自主性也增加。较大的RNA病毒，例如VEEV在其基因组中编码完整的RdRP。与较小的菲尔斯病毒科相比，这些较大的RNA病毒较少依赖宿主，因为它们中的许多还编码额外的RNA修饰因子，如参与5′Cap和3′-polyA的酶，这是翻译和潜在的RNA复制所需的。

03
合成srRNA的设计原则

根据上面所提到的，可以得出srRNA设计所需的元素（图4a），以及当前现有的srRNA系统设计的来源病毒种类（图4b）。

▲图4 自复制RNA的基本元素及主要种类

04
面临的挑战

1srRNA递送

在活细胞中的应用需要复杂的递送方法，因为srRNA必须首先穿过细胞屏障。srRNA可以通过电穿孔直接转化，但由于其对细胞的损伤较大，且难以工艺放大，因而未被广泛利用。已经开发了各种转染剂的方法，例如脂质纳米颗粒（LNP），新冠mRNA疫苗以含有mRNA的脂质纳米颗粒的形式给药，而这种方法需要正确有效地包裹目标RNA，且组分可能导致不必要的免疫原性副作用，提供可生物降解的低免疫原性组分可能是未来的发展方向。

2srRNA序列与修饰

srRNA在递送后需要成功建立复制和目的基因表达的机制，这可能需要额外的宿主特异性元件。如大多数真核基因转录物含有m7G5′-帽和3′-poly A尾，这两种元素既保护mRNA不被降解，又是有效翻译起始所必需的。事实上，一些病毒依赖于携带帽修饰的亚基因组转录物或者特定的RNA结构，如内部核糖体进入位点（IRES），也允许通过模仿翻译起始复合体从内部ORF进行翻译。另一种策略是将基因编码为长的多蛋白前体，这些前体在翻译过程中或翻译后形成最终的RdRP。srRNA的体内寿命和潜在的不良副作用取决于原始RNA和递送系统。在细菌中，这种反应可以是核糖核酸酶对srRNA的降解，也可以是CRISPR/Cas等抗病毒免疫防御对全局非特异性RNA的降解。在真核生物中，特异性模式识别受体（PRR）可以检测外源性ssRNA和dsRNA，并启动一系列反应，包括翻译的下调/抑制、程序性细胞死亡，甚至激活整个生物体的免疫。虽然在某些情况下（例如作为抗癌治疗），这些可能会达到预期效果，但在其他使用情况下（如mRNA疫苗），它们可能会产生有害影响。dsRNA可能作为单链srRNA的副产物出现，是一种有效的信号分子，通过触发I型干扰素在细胞内引起保护性抗病毒状态，从而产生干扰素刺激基因（ISG）。

总之，用于递送和修饰非复制性RNA的现有技术应该很容易适用于srRNA，并能够设计用于各种不同应用的复制性RNA载体。

8限制srRNA复制性和编码潜力的因素

尽管srRNA具有很好的潜力，但其编码能力远低于质粒或DNA病毒等传统DNA载体。与DNA相比，RNA作为遗传物质的缺点是，例如，其化学和酶稳定性较低，再加上形成热力学上非常稳定的链内和链间相互作用的趋势高得多，这可能会阻碍其复制。ssRNA病毒的复制产物具有产生双链RNA副产物的内在潜力，该副产物是由完全互补的模板和产物链的退火产生的。虽然dsRNA病毒可以通过将RdRPs和基因组RNA共包装到亚病毒颗粒中来复制其RNA，但裸胞质dsRNA通常被认为是复制无活性的，这是由于长RNA双链体的高熔融温度使得它们在没有链置换因子的情况下无法进行复制。在设计合成srRNA时，必须关注一些序列比其他序列更容易形成双链的趋势。限制srRNA编码潜力的另一个重要因素是病毒RdRPs的高错误率，这会由于有害突变的积累而阻止了长基因组上遗传信息的翻译，这是不利的，可以预见的是，随着时间的推移，这种不断增加的突变积累也可能限制srRNA在编码潜力和寿命方面的功效。这种限制治疗效用的因素可能可以通过定期重新给药来弥补。

结论

srRNA在多种应用中的潜力，如独立于DNA的基因表达和进化、无痕迹的基因工程或更有效的RNA疫苗。值得注意的是，与非复制型mRNA相比，基于srRNA的方法在医学和干细胞研究所需的剂量、给药次数和RNA制剂的总体疗效方面更具优势。通过深入研究各类RNA病毒基本结构和复制过程，可能为开发更为有效的srRNA提供帮助，加上更高效的递送技术的进步，相信srRNA在未来的生物医学领域的应用会非常广泛。

END

参考文献：

1.Lundstrom K. Self-Replicating RNA Viruses for Vaccine Development against Infectious Diseases and Cancer. Vaccines. 2021; 9(10):1187.

2.Wagner, A., & Mutschler, H. (2023). Design principles and applications of synthetic self-replicating RNAs. WIREs RNA, e1803.

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